禽流感病毒H9N6(AIV-H9N6)熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽流感病毒H9N6（AIV-H9N6）核酸檢測試劑盒（實時熒光-PCR 法）

英 文 名 ：Avian influenza virus H9N6 (AIV-H9N6) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence-PCR)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

禽類的病毒性流行性感冒，是由A型流感病毒引起禽類的一種從呼吸系統(tǒng)到嚴重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病[1]。其中禽流感病毒H9亞型，不僅可以感染禽類，也可以感染人類，特別是1999年以來，H9N2亞型AIV感染人事件的多次發(fā)生[2-3]嚴重威脅了人類健康、畜牧業(yè)生產(chǎn)和畜產(chǎn)品的貿(mào)易，其公共衛(wèi)生意義已引起*的廣泛關(guān)注[4]。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性、定量檢測禽流感病毒H9亞型，對禽流感病毒H9亞型引起的流感診斷有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對禽流感病毒H9亞型HA基因高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針， 在反應(yīng)體系中含禽流感病毒H9亞型基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測    結(jié)果的定性、定量分析。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H9 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

AIV-H9 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，

8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100

μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 AIV-H9 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye） FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴增曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，丏出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。

6.質(zhì)控標(biāo)準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線丏無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

Ø樣本檢測結(jié)果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

Ø樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

Ø陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

Ø病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

【注意事項】

Ø所有操作嚴格按照說明書進行；

Ø試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

Ø反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

Ø樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

Ø實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

Ø試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]WEBSTER R G, BEAN W J, GORMA N O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J] . Microbiol Rev, 1992, 56(1): 152 -179.

[2]GUO Y J, KRAUSS S, SENNE D A, et al. Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia

[J] .Virology, 2000, 267( 2):279 -288.

[3]唐秀英, 付朝陽, 馮菊艷. H9 亞型禽流感的流行不防制[J] . 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)進展, 2000, 2( 4): 1-3.

[4]郭元吉, 李建國, 程小雯, 等. 禽 H9N2 亞型流感病毒能感染人的發(fā)現(xiàn)[J] . 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 1999, 13( 2): 105-108.

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