產(chǎn)品介紹
禽流感病毒RT-PCR核酸檢測試劑盒說明書
【試劑盒簡介】
禽流感病毒RT-PCR 檢測試劑盒,采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR )技術(shù)檢測禽組織、分泌物和排泄物中所有亞型的AIV,適用于AIV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【原理】
利用吸附柱提取RNA作為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈;然后在DNA 聚合酶的作用下,經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán),使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、染色后,在紫外燈下,肉眼可見DNA 片段的擴增帶。
大腸菌O157檢測試劑盒(玻片乳膠凝集反應(yīng)法) |
大腸埃希氏菌血清 |
志賀氏菌診斷血清 |
無菌脫纖維馬血 |
無菌脫纖維兔血 |
【試劑盒組份】
1. 生理鹽水 | 20mL | 8. 吸附柱和收集管 | 10套 |
2. 裂解液 | 6mL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
3. 洗滌液A | 7mL | 10. RT-PCR 反應(yīng)液A | 180μL |
4. 洗滌液B | 7mL | 11. RT-PCR 反應(yīng)液B | 50μL |
5. 洗脫液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
6. 陰性對照 | 300μL | 13. 染色液 | 10μL |
7. 陽性對照 | 300μL |
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注:塑料袋內(nèi)試劑(陽性對照、RT-PCR反應(yīng)液A和B)-20 ℃凍存,裂解液2-8℃冷藏,其他室溫保存。
【操作方法】
一、樣品制備
1樣品采集::病死或撲殺的禽,取肺、脾、腦等組織;待檢活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物,放于50%甘油生理鹽水中或用注射器取血5 mL,2~8 ℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2.1 組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物;然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中,8000 rpm離心2 min,取100 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。2樣品處理:
2.2 全血樣品的處理:待血凝后取100 µL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對照的處理:取陽性對照 100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對照的處理:取陰性對照100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入450µL裂解液,充分顛倒混勻,室溫靜置3min 。
2. 加入275µL無水乙醇,輕輕混勻。
3. 將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì),以免離心時堵塞吸附柱),10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
4. 向吸附柱中加入500µL洗滌液A,10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
5. 向吸附柱中加入500µL洗滌液B,10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
6. 空柱10,000 rpm 離心2 min。
7. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中,在膜中央加入30µL洗脫液,室溫靜置2min,10,000 rpm 離心1min,獲得總RNA。
三、RT-PCR
1. 反應(yīng)體系:分別取14µL RT-PCR反應(yīng)液A(用前混勻)、4µL RT-PCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板RNA,混勻。
2. 反應(yīng)程序:在PCR儀上運行以下程序:42 ℃ 45 min,94 ℃ 3 min ;94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。
四、電泳
1. 制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2. 電泳:待膠凝固后,取5µL PCR擴增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液中電泳。
3. 染色:取50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽性對照出現(xiàn)400bp擴增帶,陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時,實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴增帶為新城疫病毒陽性,否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC )處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭(10 µL、200 µL、1000 µL)。
【注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存,使用時拿到室溫下,使用后立即放回。
3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s,使液體全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
4.嚴(yán)格按試劑盒說明書操作可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
5.RNA提取過程中,應(yīng)戴口罩、勤換手套,盡量縮短操作時間。
6.所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理,以免污染實驗室。
公司優(yōu)勢:
1)質(zhì)量:我司提供的的試劑均經(jīng)過出廠檢測。不對可退換
2)價格:價格實惠,量大從優(yōu),產(chǎn)品價格隨時會變動,實時報價還請來電獲取。
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除了禽流感病毒RT-PCR核酸檢測試劑盒??我公司還提供:
A群溶血鏈球菌T型檢測用診斷血清 |
B群鏈球菌檢測試劑盒(玻片乳膠凝集反應(yīng)) |
A群鏈球菌檢測試劑盒(玻片乳膠凝集反應(yīng)) |
腸炎弧菌檢測用診斷血清 |
沙門氏菌診斷血清 |