豬圓環(huán)病毒熒光PCR試劑盒使用說明書
【試劑盒簡介】
豬圓環(huán)病毒熒光PCR試劑盒,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測豬血清和組織中的PCV,適用于PCV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【原理】
提取DNA作為模板,在DNA聚合酶的作用下,經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán),使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行電泳、染色后,在紫外燈下,肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。
【試劑盒組份】
1. 生理鹽水 | 20mL | 8. 吸附柱和收集管 | 10套 |
2. 裂解液 | 6mL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
3. 洗滌液A | 7mL | 10. RT-PCR 反應(yīng)液A | 180μL |
4. 洗滌液B | 7mL | 11. RT-PCR 反應(yīng)液B | 50μL |
5. 洗脫液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
6. 陰性對照 | 300μL | 13. 染色液 | 10μL |
7. 陽性對照 | 300μL | | |
注:塑料袋內(nèi)試劑(陽性對照、RT-PCR反應(yīng)液A和B)-20 ℃凍存,裂解液2-8℃冷藏,其他室溫保存。
【操作方法】
一、樣品制備
1樣品采集:病死或撲殺的豬,取肺、扁桃體和腦等組織;待檢活豬,用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2樣品處理:
2.1組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物;然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取100µL上清于1.5mL滅菌離心管中。
2.2全血樣品的處理:待血凝后取100µL血清于1.5mL滅菌離心管中。
2.3陽性對照的處理:取陽性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
2.4陰性對照的處理:取陰性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
1.取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入450µL裂解液,充分顛倒混勻,室溫靜置3min。
2.加入275µL無水乙醇,輕輕混勻。
3.將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì),以免離心時堵塞吸附柱),10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
4.向吸附柱中加入500µL洗滌液A,10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
5.向吸附柱中加入500µL洗滌液B,10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
6.空柱10,000rpm離心2min。
7.將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中,在膜中央加入30µL洗脫液,室溫靜置2min,10,000rpm離心1min,獲得總RNA。
三、RT-PCR
1.反應(yīng)體系:分別取14µLRT-PCR反應(yīng)液A(用前混勻)、4µLRT-PCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板RNA,混勻。
2.反應(yīng)程序:在PCR儀上運(yùn)行以下程序:42℃45min,94℃3min;94℃30s、53℃30s、72℃30s,35個循環(huán);72℃延伸10min。
四、電泳
1.制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳:待膠凝固后,取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色:取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽性對照出現(xiàn)494bp擴(kuò)增帶,陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時,實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)494bp擴(kuò)增帶為豬藍(lán)耳病毒陽性,否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
【豬圓環(huán)病毒熒光PCR試劑盒注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存,使用時拿到室溫下,使用后立即放回。
3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s,使液體全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
4.嚴(yán)格按試劑盒說明書操作可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
5.RNA提取過程中,應(yīng)戴口罩、勤換手套,盡量縮短操作時間。
6.所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理,以免污染實驗室。