豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒使用說明
【試劑盒簡介】
豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測豬血清和組織中的PRV,適用于PRV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【原理】
提取DNA作為模板,在DNA聚合酶的作用下,經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán),使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行電泳、染色后,在紫外燈下,肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。
【試劑盒組份】
1. 裂解液 | 8mL | 8. 陽性對照 | |
2. 蛋白酶K | 110μL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
3. 抽提液 | 8mL | 10. PCR 反應(yīng)液A | 180μL |
4. 異丙醇 | 7mL | 11. PCR 反應(yīng)液B | 50μL |
5. 洗滌液 | 12mL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
6. 無菌水 | 500μL | 13. 染色液 | |
7. 陰性對照 | 300μL | | 10μL |
注:塑料袋內(nèi)試劑(陽性對照、蛋白酶K、PCR反應(yīng)液A和B)-20 ℃凍存,其他室溫保存。
黃曲霉毒素M1檢測試劑盒(酶免)
三聚氰胺檢測試劑盒(酶免)
磺胺二甲基嘧啶檢測試劑盒(酶免)
孔雀石綠定量檢測試劑盒(酶免)
金霉素定量檢測試劑盒(酶免)
【豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒操作方法】
一、病毒DNA的提取
1.取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動,不要吸到上層保護(hù)液),用力顛倒10次混勻,12,000rpm離心10min。
2.取500µL上清置于滅菌離心管中,加入500µL異丙醇,混勻,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管,室溫融化,13,000rpm離心15min。
3.棄上清,沿管壁緩緩加入1mL洗滌液,輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉,將離心管倒扣于吸水紙上1min,再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
4.用30µL無菌水溶解沉淀,作為模板備用。
二、樣品制備
1.樣品采集:病死或撲殺的豬,取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結(jié)等組織;待檢活豬,用棉拭子取鼻腔分泌物,置于50%甘油生理鹽水中,或用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2.樣品處理:
2.1組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物;然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心5min,取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
2.2全血樣品的處理:待血凝后取血清放于離心管中,8000rpm離心5min,取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
2.3陽性對照的處理:混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
2.4陰性對照的處理:混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
三、PCR
1.反應(yīng)體系:分別取16µLPCR反應(yīng)液A(用前混勻)、2µLPCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板DNA,混勻。
2.反應(yīng)程序:在PCR儀上運(yùn)行以下程序:94℃3min;94℃30s、55℃30s、72℃30s,35個循環(huán);72℃延伸10min。
四、電泳
1.制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳:待膠凝固后,取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色:取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽性對照出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶,陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時,實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為豬偽狂犬病毒陽性,否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
【豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存,使用時拿到室溫下,使用后立即放回。